作者：陕西师范大学 张婧 翟琳 蒋荣丽
摘要：本研究应用双向电泳（two dimentional electrophoresis, 2DE）和联合质谱分析技术，通过对正常状态及运动疲劳状态下个体间的血浆蛋白质组比较分析，得到了分辨率较高、重复性较好电泳图谱，经过分析比较及质谱鉴定，最终鉴定出16个差异蛋白点，去除结果相同的蛋白，共包含12种蛋白，蛋白质评分均大于56 （p<0.05），说明鉴定结果高度可信。其中运动疲劳后表达上调的蛋白和表达下调的蛋白各为6种，表达下调的蛋白有α1-B-糖蛋白、丛生蛋白、免疫球蛋白α1链C结构域、血管紧张素原、补体C4-A和结合珠蛋白；表达上调的蛋白有α2-HS-糖蛋白、抗凝血酶-III、血清白蛋白、CD5抗原、结合珠蛋白相关蛋白、载脂蛋白E。这些差异性蛋白质涉及到急性相蛋白、免疫相关蛋白、脂代谢相关蛋白和神经调节相关蛋白。至于这些差异蛋白是否具有运动性疲劳判断的特异性以及怎样发挥其生物学功能还需进一步研究。由于目前的研究仅仅是蛋白质组学初筛实验，还需利用其他生物学方法如ELISA等进行蛋白功能的验证，并进一步扩大样本例数进行验证实验。总之，本研究将为筛选运动疲劳特异性血清蛋白标志物以及抗运动性疲劳药物筛选的靶点确定提供一定的实验依据和理论基础。
四、论文正文（不超过5000字）
运动性疲劳相关血清差异蛋白筛选研究
张婧 翟琳 蒋荣丽
陕西师范大学
1.研究目的
本研究应用蛋白质组学技术，通过对正常状态及运动疲劳状态下个体间的血浆蛋白质组比较分析，筛选出与运动性疲劳发生、发展中相关的异常蛋白质，寻找潜在的与运动性疲劳密切相关的血浆特异性生物标志物，可为运动性疲劳的早期诊断和科学健身的评价提供可靠的实验依据，并为抗运动性疲劳药物的开发提供新的分子靶标。
2.研究方法
2.1研究对象
以年龄为17-21岁的2012级体育教育专业10名男生为研究对象。如表2-1、图2-1所示，其体质指数（BMI）为19＜BMI＜24，身高、体重大多符合标准，个别也仅在标准身高和体重的2%上下浮动；体质成分中肌肉含量和脂肪含量也在标准含量的2%上下浮动。
2.2疲劳模型建立
表2-1 研究对象的基本特征
Table 2-1 The characteristic of participants
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一 |
学校体育理论与学校体育史研究 |
|
样本序号 |
年龄（Y） |
身高（m） |
体重（Kg） |
BMI（Kg/m2） |
|
1 |
19 |
1.83 |
71.1 |
21.23 |
|
2 |
20 |
1.74 |
72.5 |
23.95 |
|
3 |
18 |
1.75 |
68.3 |
22.30 |
|
4 |
19 |
1.74 |
69.2 |
22.86 |
|
5 |
18 |
1.67 |
65.5 |
23.49 |
|
6 |
20 |
1.75 |
70.0 |
22.86 |
|
7 |
19 |
1.83 |
77.6 |
23.17 |
|
8 |
20 |
1.80 |
68.4 |
21.10 |
|
9 |
21 |
1.75 |
61.2 |
19.98 |
|
10 |
17 |
1.70 |
66.0 |
22.84 |
图2-1 研究对象体质成分与标准比较
Figure 2-1 The physical composition compared with standard for participants
各研究对象以最大心率85%进行平板跑台运动，通过《主观体力感觉等级量表》进行运动疲劳状态的评定[1-3]，至主观体力感觉等级到12-14（即有点困难，见表2-2）视为疲劳。同时测定其最大吸氧量、呼吸频率，并在运动前、运动后3分钟分别测定受试者的心率、血压，同时分别取血3mL以制备血清，测定血糖（BG）、血红蛋白（Hb）和乳酸脱氢酶（LDH）等生化指标对疲劳程度进行界定。
表2-2 主观体力感觉等级量
Table 2-2 Ratings of perceived exertion
|
RPE 值 |
7～8 |
9 |
10～12 |
12～14 |
15～16 |
17～18 |
19～20 |
|
主观运 动感觉 |
非常轻松 |
很轻松 |
轻松 |
有点困难 |
困难 |
非常困难 |
极其困难 |
2.3样品的采集
运动前、后收集静脉血于采血管中，待血液自然凝固后，用牙签沿管壁轻轻剥离血凝块，避免溶血。4℃下冷冻离心（2000g）10min，吸取上清液（血清）于-80℃保存备用。
2.4蛋白质双向电泳
表2-3 12.5% SDS-PAGE凝胶配方
Table 2-3 Gel formula of 12.5% SDS-PAGE
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Reagents |
Volumn of reagents |
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6张胶 |
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本研究中人血清蛋白的双向电泳分析、凝胶图像分析和质谱检测与分析均在广州辉骏生物科技有限公司按试剂盒操作说明书或常规实验操作方法完成。简单描述包括以下步骤：（1）一向等点聚焦：此过程中包括蛋白质溶解、定量、上样、泡胀、等电聚焦等步骤。（2）二向SDS-PAGE：SDS-PAGE凝胶配方如表2-3。这一步包括装灌胶器、配液灌胶、准备玻璃板、配置上槽液、胶条平衡、配置上槽液、垂直电泳和染色等步骤。
首先要进行质谱前处理，包括挖点、酶切、肽段抽提和点靶。然后利用德国布鲁克MALDI-TOF-TOF质谱仪进行质谱鉴定。利用软件flexAnalysis（Bruker Dalton）对质谱峰进行处理后，再利用BioTools（Bruker Dalton）软件通过搜索NCBI数据库，查询匹配的相关蛋白质，并查询其功能，以鉴定的蛋白质名称或种类。
3.结果与分析
本研究结果显示（如图3-1所示），运动后血红蛋白（Hb）、血糖（BG）和乳酸脱氢酶（LDH）运动疲劳后分别下降了约24%、31%和16%。
图3-1 运动疲劳前后几个生化指标变化百分比
Figure 3-1 Change of several biochemical criterions before or after exercise-induced fatigue
长时间大运动负荷训练可导致机体Hb降低，形成运动性Hb低下状态[4,5]，进而引起红细胞运输氧和二氧化碳的能力及物质代谢能力下降，影响运动能力，可能导致疲劳的发生。本研究结果显示（如图3-1所示），运动后Hb下降了约24%。如果按照运动前正常Hb的最低浓度120 g/L计算，运动后Hb的浓度就为91.2 g/L，按照男性贫血的临床判断标准（﹤120g/L）, 这已经接近中度贫血（﹤90g/L）。提示疲劳模型建立成功。
机体在进行长时间强度较大的运动时，为了维持运动肌肉所需要不间断的能量供应，BG经血液循环被输送到骨骼肌中满足机体运动的能量需求。通常情况下，机体BG水平很稳定。但是，当激烈运动使肌糖原、BG大量消耗，而肝糖原分解和糖异生作用又不能保证BG的补充时，BG水平就会降低。同时，由于BG还是中枢神经系统、红细胞等组织必需的供能物质，所以一旦BG降低可能会出现头晕、恶心等症状。文镜[6]等研究发现，小鼠游泳70 min时血糖水平、血糖下降值和血糖下降速率能够较好地反映小鼠在长时间运动中体内糖储备的变化情况，测定安静值的负重（体重3%）游泳70 min时血糖值，能够作为评价影响糖代谢抗疲劳保健食品的一项指标。本研究结果显示（如图3-1所示），运动后BG下降了约31%，如果按照运动前正常BG的最高浓度6.6 mmol/L计算，运动后BG的浓度就为4.6 mmol/L，接近正常BG的最低浓度4.4 mmol/L，说明本研究运动疲劳模型建立时，血糖浓度大幅度降低，疲劳可能已经出现。
LDH是糖酵解过程中催化丙酮酸和乳酸转化的一种酶。大强度运动后血清中LDH的活性会升高，其机制一方面是因为大强度运动过程中，糖酵解功能系统占主导地位，另一方面可能是因为运动时由于机械牵拉或损伤使得细胞膜通透性增加。但是本研究结果显示（如图3-1所示），运动后血清LDH下降了约16%，其原因可能是，本研究在模型建立时采取的运动方案属于中等强度的运动，其主要以有氧代谢供能为主，而在有氧代谢过程中丙酮酸会在丙酮酸脱氢酶系的作用下进入三羧酸循，所以乳酸脱氢酶活性会下降。
3.2双向电泳和质谱分析结果
3.2.1运动疲劳前血清蛋白质组的双向电泳分离
对蛋白质样品在相同条件下进行3次双向电泳，利用ImageMaster 2D platinum 5.0软件进行图像的强度校正、点检测、匹配等分析。根据蛋白质点表达量与所有匹配蛋白质点表达量总和的比值大于2.0，且同组3块胶图谱中都出现相同变化的蛋白点，被认为是差异蛋白质点。比较结果发现，运动疲劳前后共检测出34个差异蛋白质点。具体双向电泳图谱及差异蛋白点的位置如图3-2所示A1~A56为运动疲劳后表达下降的蛋白质点；如图3-3所示，B1~B33为运动疲劳后表达升高的蛋白质点。
图3-2运动前血清蛋白质组的双向电泳图谱
Figure 3-2 Serum proteomic two-dimensional electrophoresis before exercise
图3-3运动后血清蛋白质组的双向电泳图谱
Figure 3-3 Serum proteomic two-dimensional electrophoresis after exercise
3.2.2运动疲劳前后差异蛋白点的质谱鉴定结果
本研究最终从电泳图谱中选取16个差异蛋白点进行胶内酶解，MALDI-TOF/TOF质谱分析显示，大多数肽质量指纹图谱背景低，峰信号较强。通过Mascot软件检索SwissProt数据库鉴定蛋白，去除鉴定结果相同的蛋白点，共鉴定出12种蛋白质，蛋白质评分均大于56 （p<0.05），说明鉴定结果高度可信。具体蛋白质质谱鉴定和搜库结果见表2-4。
3.3运动疲劳前后血清蛋白质组差异性变化
本研究通过双向电泳（two dimentional electrophoresis, 2DE）联合质谱分析技术，对运动疲劳前后血清蛋白质组进行差异性研究，得到了分辨率较高、重复性较好电泳图谱，经过分析比较及质谱鉴定，最终鉴定出16个差异蛋白点，去除结果相同的蛋白，共包含12种蛋白，其中运动疲劳后表达上调的蛋白和表达下调的蛋白各为6种（如表2-4所示）。
表达下调的蛋白有α1-B-糖蛋白、丛生蛋白、免疫球蛋白α1链C结构域、血管紧张素原、补体C4-A和结合珠蛋白。
表2-4 差异蛋白的质谱鉴定结果
Table 2-4 The spectrum identification results of differential proteins
|
Spot No. |
Accession No. |
Protein name |
MW |
PI |
Protein scores |
after Fatigue |
AA |
|
A06 A14 A15 A16 A39 A42 B13 B14 B15 B17 B21 B24 |
NP_570602 NP_001822 P01876 AAA51679 P0C0L4 P00738 P02765 P01008 P02768 O43866 P00739 P02649 |
Alpha-1B-glycoprotein Ig α-1 chain C region Haptoglobin Alpha-2-HS-glycoprotein Antithrombin-III Serum albumin CD5 antigen-Like Apolipoprotein E |
54273 53031 37655 53154 192771 45205 39325 52602 69367 38088 39030 36154 |
5.58 5.89 6.08 5.87 6.65 6.13 5.43 6.32 5.92 5.28 6.63 5.65 |
104 88 90 208 120 154 170 234 266 125 228 335,406 |
|
495 449 353 485 1774 406
464 609 347 348 317 |
董凌月[7]等研究认为人α-1B糖蛋白是免疫球蛋白超家族的一个新成员，可能和金属蛋白酶抑制因子一样具有蛋白酶抑制剂作用，推断α-1B糖蛋白可能在细胞识别和细胞行为的调节方面起作用[8]。丛生蛋白（CLU, clusterin）与许多生理和病理过程有关[9]，包括补体抑制[10]、炎症调节[11]、脂质转运[12]、细胞凋亡[13]、细胞分化[14]、食欲调节[15]和蛋白质量控制[16]等。有关运动和丛生蛋白的关系未见报道。
免疫球蛋白α1链（IGHG1）属于免疫球蛋白重链之一。运动后有关Ig的变化报道不一致，有的是增加[17,18]，有的是降低[19]，也有的是不变[20,21]。血管紧张素原（Angiotensinogen）是一种血清球蛋白，是合成血管紧张素的前体。血管紧张素是一类具有极强的缩血管和刺激肾上腺皮质分泌醛固酮等作用的肽类物质，参与血压及体液的调节。补体C4（Complement C4）是一种多功能β1-球蛋白，存在于血浆中。Ernst等研究发现，运动后补体C4略有上升，无统计学意义[22]。触珠蛋白（Haptoglobin, Hp）是血清α2球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白，在参与宿主抗感染、损伤组织的修复以及维持内环境稳定等方面起着重要作用[23]。Hp的主要功能是通过捕捉血红蛋白保护组织免受抗氧化损伤[24,25]。运动疲劳后，Hp表达下调，是否和运动疲劳后血红蛋白下降有关，还需进一步实验研究。
本研究结果显示，运动疲劳后这几种蛋白下调，似乎与疾病状态下这些蛋白表达相悖。一方面，因为这些蛋白大多是通过蛋白质组学手段正处于筛选研究阶段，研究对象不同结果就会有所差异。例如，Ghafouri等[26]对患有骨骼肌肉症候群（MSD）的农民的血浆蛋白组学研究结果表明，还有MSD的农民血浆中触珠蛋白、补体因子B表达上调；α1-B-糖蛋白表达下调。因为运动性疲劳并不是一种疾病状态，在疾病状态下尤其较严重时（例如癌症），人体自身的免疫力已经无法产生抵抗，但是运动性疲劳经过休息机体可以自愈。所以，本研究结果说明运动性疲劳状态下，机体内产生代偿性反应，这可能是运动性疲劳自愈机制之一。但是这些蛋白是否可以作为运动性疲劳判断的分子靶标，还需要进一步实验验证。
3.3.2 运动疲劳后血清中表达上调的蛋白质
表达上调的蛋白有α2-HS-糖蛋白、抗凝血酶-III、血清白蛋白、CD5抗原、结合珠蛋白相关蛋白、载脂蛋白E。
α2-HS-糖蛋白（Alpha-2-HS-glycoprotein, A2HSG）在机体内主要参与血管钙化、骨代谢调节、胰岛素抵抗、蛋白酶活性调控、角质形成细胞迁移及乳腺肿瘤细胞增殖的信号转导等生理病理过程[27-31]，同时也被确定为神经退行性疾病的生物标志物[32]。在本研究中，运动疲劳后血浆蛋白组学结果表明，A2HSG表达上升，这可能主要与胰岛素抵抗、蛋白酶活性调控有关；抗凝血酶III表达上调，可能与运动引起血液循环加速有关；SAL表达上调，可能是由于运动疲劳引起Hb下降，其代谢产物胆红素升高；CD5L表达上升高可能与疲劳后机体代谢产生的“垃圾”增多有关，因为CD5L也被认为是巨噬细胞凋亡抑制剂，是富“含半胱氨酸结构域的清道夫受体”超家族蛋白之一[33]。结合珠蛋白相关蛋白（Haptoglobin-related protein，Hpr）是和机体非特异性免疫功能有关的一种蛋白质[34]。载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）是一种多态性蛋白，参与脂蛋白的转化与代谢，推测载脂蛋白E的上调可能与运动引起脂肪供能比例增加，脂肪动员加速，血浆甘油三酯含量上升有关。
4.结论与建议
综上所述，本研究发现运动疲劳后表达差异的蛋白质涉及到急性相蛋白、免疫相关蛋白、脂代谢相关蛋白和神经调节相关蛋白。至于这些差异蛋白是否具有运动性疲劳判断的特异性以及怎样发挥其生物学功能还需进一步研究。由于目前的研究仅仅是蛋白质组学初筛实验，还需利用其他生物学方法如ELISA等进行蛋白功能的验证，并进一步扩大样本例数进行验证实验。总之，本研究将为筛选运动疲劳特异性血清蛋白标志物以及抗运动性疲劳药物筛选的靶点确定提供一定的实验依据和理论基础。
5.参考文献
[1] Borg G A. Perceived exertion as an indicator of somatic stress [J]. Scandinavian journal of rehabilitation medicine, 1970, 2(2): 92-98.
[2] Borg G A. Perceived exertion: A note on “history” and methods [J]. Medcine science sports, 1973, 5(2): 90-93.
[3] Borg G A. Psychophysical bases of perceived exertion [J]. Medcine science sports, 1982, 14(5): 377-381.
[4] 翁锡全, 余群, 林文弢, 等. 低氧暴露对运动诱导的血红蛋白低下大鼠红细胞参数和某些造血因子的影响 [J]. 中国运动医学杂志, 2006, 25(5): 538-542.
[5] Magalhaes J, Ascensao A, Soares J M C, et al. Acute and severe hypobaric hypoxia-induced muscle oxidative stress in mice: the role of glutathione against oxidative damage [J]. European journal of applied physiology, 2004, 91(2-3): 185-191.
[6] 文镜, 陈文, 金宗镰. 用血糖动态变化评价抗疲劳功能食品可行性的研[J]. 食品科学, 1997, 18(11): 6-10.
[7] 董凌月. α-1B糖蛋白前体基因的表达调控分析 [D]. 中国医科大学, 2003.
[8] 孙 迪, 赵彦艳, 戴书萍 等. 人类免疫球蛋白超家族一个新成员: A-1B糖蛋白前体基因的克隆和分析 [J]. 遗传学报, 2002, 29(4): 299-302.
[9] 马晓, 李鹤成. Clusterin 在恶性肿瘤治疗中的研究进展 [J]. 肿瘤, 2013, 33(4): 368-371.
[10] McDonald J F, Nelsestuen G L. Potent inhibition of terminal complement assembly by clusterin: characterization of its impact on C9 polymerization [J]. Biochemistry, 1997, 36(24): 7464-7473.
[11] Falgarone G, Chiocchia G. Clusterin: A multifacet protein at the crossroad of inflammation and autoimmunity [J]. Advances in cancer research, 2009, 104: 139-170.
[12] De Silva H V, Stuart W D, Duvic C R, et al. A 70-kDa apolipoprotein designated ApoJ is a marker for subclasses of human plasma high density lipoproteins [J]. Journal of Biological Chemistry, 1990, 265: 13240-13247.
[13] Kim N, Yoo J C, Han J Y, et al. Human nuclear clusterin mediates apoptosis by interacting with Bcl-XL through C-terminal coiled coil domain [J]. Journal of cellular physiology, 2012, 227(3): 1157-1167.
[14] Ahuja H S, Tenniswood M, Lockshin R, et al. expression of clusterin in cell differentiation and cell death [J]. Biochemistry and cell biology, 1994, 72(11-12): 523-530.
[15] Bajari T M, Strasser V, Nimpf J, et al. A model for modulation of leptin activity by association with clusterin [J]. The FASEB journal, 2003, 17(11): 1505-1507.
[16] Carver J A, Rekas A, Thorn D C, et al. Small Heat‐shock Proteins and Clusterin: Intra‐and Extracellular Molecular Chaperones with a Common Mechanism of Action and Function? [J]. IUBMB life, 2003, 55(12): 661-668.
[17] Nieman D C, Nehlsen-Cannarella S L. The effects of acute and chronic exercise on immunoglobulins [J]. Sports Medicine, 1991, 11(3): 183-201.
[18] Nehlsen-Cannarella S L, Nieman D C, Balk-Lamberton A J, et al. The effects of
moderate exercise training on immune response [J]. Medicine Science Sports Exercise, 1991, 23(1): 64-70.
[19] Mackinnon L T, Hooper S. Mucosal (secretory) immune system responses to
exercise of varying intensity and during overtraining [J]. International Journal of Sports Medicine, 1994, 15(S 3): S179-S183.
[20] Poortmans J R. Serum protein determination during short exhaustive physical activity [J]. Journal of applied physiology, 1971, 30(2): 190-192.
[21] Nieman D C, Tan S A, Lee J W, et al. Complement and immunoglobulin levels in athletes and sedentary controls [J]. International journal of sports medicine, 1989, 10(2): 124-128.
[22] Ernst E, Saradeth T, Achhammer G. n-3 fatty acids and acute‐phase proteins [J]. European journal of clinical investigation, 1991, 21(1): 77-82.
[23] Tseng C F, Lin C C, Huang H Y, et al. Antioxidant role of human haptoglobin [J]. Proteomics, 2004, 4(8): 2221-2228.
[24] Dobryszycka W. Biological functions of haptoglobin-new pieces to an old puzzle [J]. European journal of clinical chemistry and clinical biochemistry, 1997, 35(9): 647-654.
[25] Lim Y K, Jenner A, Ali A B, et al. Haptoglobin reduces renal oxidative DNA and tissue damage during phenylhydrazine-induced hemolysis [J]. Kidney international, 2000, 58(3): 1033-1044.
[26] Ghafouri B, Carlsson A, Holmberg S, et al. Biomarkers of systemic inflammation in farmers with musculoskeletal disorders; a plasma proteomic study [J]. BMC musculoskeletal disorders, 2016, 17(1): 206-216.
[27] Clerc F, Reiding K R, Jansen B C, et al. Human plasma protein N [J]. Glycoconjugate journal, 2016, 33(3): 309-343.
[28] Brylka L, Jahnen-Dechent W. The role of fetuin-A in physiological and pathological mineralization [J]. Calcified tissue international, 2013, 93(4): 355-364.
[29] Jahnen-Dechent W, Heiss A, Schäfer C, et al. Fetuin-A regulation of calcified matrix metabolism [J]. Circulation research, 2011, 108(12): 1494-1509.
[30] Ray S, Lukyanov P, Ochieng J. Members of the cystatin superfamily interact with MMP-9 and protect it from autolytic degradation without affecting its gelatinolytic activities [J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 2003, 1652(2): 91-102.
[31] Mathews S T, Chellam N, Srinivas P R, et al. α 2-HSG, a specific inhibitor of insulin receptor autophosphorylation, interacts with the insulin receptor [J]. Molecular and cellular endocrinology, 2000, 164(1): 87-98.
[32] Mori K, Emoto M, Inaba M. Fetuin-A: a multifunctional protein [J]. Recent Pat Endocrine metabolism Immune Drug Discover. 2011; 5 (2): 124-146.
[33] Tissot J D, Sanchez J C, Vuadens F, et al. IgM are associated to Sp alpha (CD5 antigen-like) [J]. Electrophoresis, 2002, 23(7-8):1203-1206.
[34] Singh V, van Pelt E D, Stoop M P, et al. Gray matter-related proteins are associated with childhood-onset multiple sclerosis [J]. 2015, 2(5): e155.